据推测，胰岛素受体信号传导在突触可塑性中发挥作用，然而该受体在中枢神经系统的功能尚不明确。为验证胰岛素受体信号是否影响视觉系统功能，研究人员在活体非洲爪蟾蝌蚪中记录了顶盖神经元的光诱发反应。与对照组相比，转染了降低胰岛素受体磷酸化的显性阴性胰岛素受体（dnIR）或降低胰岛素受体总蛋白水平的胰岛素受体吗啉代寡核苷酸的顶盖神经元，其光诱发反应显著减弱。通过电镜评估发现，表达dnIR的神经元突触密度降低，AMPA微兴奋性突触后电流频率下降，且经验依赖性树突棘结构可塑性发生改变。而通过双脉冲反应评估的突触小泡释放概率，以及通过AMPA/NMDA比值和超微结构标准评估的突触成熟度，均未受dnIR表达的影响。这些数据表明，胰岛素受体信号通过控制突触密度来调节神经环路功能和可塑性。
一、介绍
胰岛素受体是一种受体酪氨酸激酶，其调节外周葡萄糖代谢的功能已被充分研究。尽管大脑中胰岛素受体的表达早在数十年前已被发现，但这一经典"胰岛素不敏感"器官中胰岛素受体的功能仍不甚明确。胰岛素受体本质上是二硫键连接的二聚体，由细胞外胰岛素结合结构域和细胞内酪氨酸激酶结构域组成。配体结合及后续激酶活性会启动磷酸化级联反应，进而引发不同的生物学功能。新兴数据支持大脑是胰岛素靶器官的观点，且脑内胰岛素受体信号在神经元存活、突触可塑性以及学习记忆中发挥着多重作用。神经元去极化会释放脑胰岛素，而其底物IRSp53会响应活动转位至突触，这表明胰岛素受体信号可能以活动依赖性方式增强。细胞培养研究表明，胰岛素受体信号可调控树突棘密度和神经突生长；然而，胰岛素受体信号在控制中枢神经环路结构与功能中的作用尚未在体内得到证实。
展开剩余94%本研究通过操作单个顶盖神经元中胰岛素受体蛋白水平或其信号传导，证明胰岛素受体通过影响顶盖神经元对视觉刺激的反应，在视觉环路功能中起关键作用。此外，我们根据电生理和超微结构标准证实，胰岛素受体功能通过调节突触数量来影响环路特性。多光子延时成像数据进一步显示，胰岛素受体介导了经验依赖性的树突结构可塑性。我们的研究证明，胰岛素受体信号不仅参与感觉信息处理，还通过调节突触维持促进经验依赖性结构可塑性，这对神经元整合入脑环路至关重要。
图1 非洲爪蟾视觉系统中的胰岛素受体定位
二、结果
01.胰岛素受体在蝌蚪中枢神经系统的定位
在哺乳动物中枢神经系统中，胰岛素受体广泛但选择性地表达于特定脑区。在非洲爪蟾视网膜-顶盖环路中，胰岛素受体免疫反应性广泛分布。在顶盖内部，胰岛素受体免疫反应性定位于整个神经元成熟过程的头尾轴上的神经元，这表明胰岛素受体在神经元的整个生命周期中发挥作用。细胞核中未见胰岛素受体免疫反应性。其主要存在于主树突中，并在神经纤维网中呈现密集的点状分布模式。在眼球中，所有细胞层均存在胰岛素受体免疫反应性，包括视网膜神经节细胞层，且在突触层中呈现点状分布模式。
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02.体内胰岛素受体信号的操作
为研究胰岛素受体信号在中枢神经系统中的功能，研究人员从阶段47/48蝌蚪脑的cDNA文库中克隆了非洲爪蟾胰岛素受体。经鉴定存在两种形式的胰岛素受体。序列分析表明这两种非洲爪蟾脑胰岛素受体高度相似，均为与人类缺失第11外显子的胰岛素受体亚型同源的剪接变体。
研究人员将含量更丰富的胰岛素受体形式亚克隆至双启动子双向表达质粒中，通过电转染该构建体到顶盖神经元，可影响胰岛素受体信号传导，并通过GFP标记的顶盖神经元进行后续体内结构和功能实验。由于绝大多数胰岛素受体信号传导需要其激酶活性，研究人员通过点突变消除了胰岛素受体与ATP的结合能力。胰岛素受体需要形成二硫键连接的二聚体才能成为功能性受体。配体结合后，需要通过构象变化实现分子内转磷酸化来激活激酶。因此研究人员预期，突变型胰岛素受体可与内源性胰岛素受体形成二聚体，通过阻断内源性胰岛素受体的磷酸化并可能隔离配体，发挥显性阴性受体的功能。已有研究证实，ATP结合位点的突变可通过消除胰岛素受体激酶活性而不影响其与胰岛素的结合亲和力，对胰岛素诱导的功能产生显性阴性效应。
图2 胰岛素受体信号传导的操作
为评估构建的爪蟾胰岛素受体载体，研究人员用串联标记CFP与HA的wtIR和dnIR转染COS1细胞。HA标签可用于免疫共沉淀实验，CFP标签则能通过Western Blot上27kD的分子量差异区分外源表达与内源性胰岛素受体。为验证外源表达的dnIR是否能结合并干扰内源性胰岛素受体活性，研究人员使用抗HA抗体进行免疫共沉淀实验。结果显示wtIR与dnIR均能与内源性胰岛素受体发生共沉淀，表明两者均可与内源性受体相互作用。与wtIR共沉淀的内源性胰岛素受体发生磷酸化，而与dnIR共沉淀的则未检测到磷酸化信号，这证明dnIR表达可阻断内源性胰岛素受体的磷酸化过程。
在后续实验中，研究人员在相同条件下表达wtIR与dnIR。由于dnIR仅在ATP结合位点发生点突变，其完全保留wtIR的结构特性仅缺失激酶活性。该突变不影响胰岛素结合亲和力，且dnIR在配体结合时具有与wtIR相同的构象变化，表明两者在配体结合胞外域和二聚体相互作用胞内域均保持完好。因此研究人员推断，wtIR表达可作为dnIR过表达非特异性效应的对照。
此外，研究人员针对爪蟾胰岛素受体保守区域设计吗啉代寡核苷酸（moIR），并设置含五个错配碱基的对照吗啉代（moCTRL）。实验证实moIR能显著降低HEK293细胞中爪蟾胰岛素受体的表达。这些工具使研究人员能通过胰岛素受体敲降和显性阴性抑制两种策略研究胰岛素受体信号在神经环路功能中的作用。
为验证胰岛素受体对环路功能的重要性，研究人员在完整动物中记录顶盖神经元对自然光刺激的反应。通过向蝌蚪视网膜施加10^-8至10^-1相对光强度的刺激序列，分别记录对照组与转染GFP、wtIR或dnIR的顶盖神经元的光诱发复合突触电流。当给予2.5秒视觉刺激时，对侧顶盖神经元会对光刺激的起始与终止产生反应。由于OFF反应通常比ON反应更显著稳定，研究人员选取光刺激终止后1.5秒内的总电荷转移量进行分析。该时间窗口既能保证多数反应恢复基线，又可最大限度减少非视觉相关的自发活动干扰。在-70mV保持电位下记录的诱发复合突触电流，既包含单突触谷氨酸能电流，也整合了抑制性与兴奋性输入的多突触反应，可作为视觉环路功能的有效读数。
图3 正常顶盖细胞对视觉输入的反应需要胰岛素受体信号传导
在最低相对强度10^-8的光刺激下，大多数对照神经元未显示诱发反应（图3A）。随着光照强度增加，视觉刺激诱发的复合突触电流在幅度和持续时间上均呈现增强趋势，在相对强度10^-3时达到峰值，随后在10^-1强度时减弱（图3A、3B及表1）。由于表达GFP的神经元记录的诱发复合突触电流与未转染细胞相当（表1），本实验将未转染与表达GFP的对照神经元数据合并，并以此作为后续所有实验的对照组。
表达dnIR的顶盖神经元中，视觉刺激诱发反应幅度仅为对照组的一半左右（图3A、3B及表1）。对诱发复合突触电流起始50毫秒时间窗内电荷转移的分析显示，与对照组相比，表达dnIR的顶盖神经元视觉反应存在缺陷（图3A、3D及表1）。该时间窗此前已被证实主要反映直接兴奋性输入。另一方面，表达wtIR的顶盖神经元反应与对照组无显著差异（图3A、3B、3D及表1）。
表1.不同LED强度下视觉刺激诱发反应的电荷转移量
本表统计了视觉刺激终止后1.5秒时间窗内的总电荷转移量，以及诱发反应起始后50毫秒时间窗内的初始电荷转移量。在所有测试强度下，GFP对照组、未转染对照组和moCTRL对照组的反应数据均具有可比性。星号标示了wtIR与dnIR实验组相对于合并GFP对照组和未转染对照组数据的对照组之间，或moIR组与moCTRL组之间具有统计学显著差异。
研究人员进一步通过吗啉代介导的基因敲降技术评估胰岛素受体在视觉系统反应中的功能。记录转染荧光标记moIR或moCTRL的顶盖神经元光诱发反应时发现，与moCTRL相比，moIR显著降低了视觉反应幅度（图3A、3C及表1）及初始电荷转移量（图3A、3E及表1）。这些数据共同表明，胰岛素受体对视觉环路中兴奋性视网膜-顶盖传导至关重要，且dnIR表达引起的胰岛素受体信号缺陷足以导致视觉反应减弱。值得注意的是，moIR与dnIR对视觉反应的削弱程度相当，提示dnIR表达细胞中的磷酸化缺陷实质上模拟了蛋白缺失效应。因此后续实验采用dnIR来探究胰岛素受体信号调控视觉系统功能的机制。同时，由于表达wtIR的顶盖神经元反应与对照组相当，wtIR表达可作为dnIR过表达潜在非特异性效应的对照。
为探究胰岛素受体如何影响兴奋性输入及环路功能，研究人员检测了表达GFP、wtIR和dnIR的顶盖神经元自发性AMPA微兴奋性突触后电流特性。AMPA微兴奋性突触后电流振幅变化通常反映突触后神经递质受体数量改变，频率变化则提示突触位点数量或突触前囊泡释放概率的改变。与GFP对照组相比，dnIR表达神经元的AMPA微兴奋性突触后电流频率显著降低（图4A、4C、4D），而wtIR表达神经元与对照组无差异（图4A、4C、4D）。三组间AMPA微兴奋性突触后电流振幅未见变化（图4B、4E、4F），表明wtIR或dnIR的异位表达未改变突触后AMPA受体数量。各组GABA微抑制性突触后电流的频率与振幅均无显著差异，说明胰岛素受体功能特异性影响兴奋性突触传递。
图4 胰岛素受体信号传导调节AMPA受体介导的微兴奋性突触后电流频率
为验证AMPA微兴奋性突触后电流频率的降低是否反映突触前囊泡释放的变化，研究人员对视交叉施加成对刺激并记录顶盖神经元中诱发的AMPA受体介导的突触电流。这种双脉冲刺激范式已被广泛用于检测释放概率的变化（图5A）。在表达GFP、wtIR和dnIR的顶盖神经元中，各组间的双脉冲比率无显著差异（图5B），这表明顶盖神经元中的胰岛素受体信号不会逆行影响视网膜神经节细胞的突触小泡释放。
图5 胰岛素受体信号传导不改变突触前小泡释放概率或电生理突触成熟度
为验证胰岛素受体信号是否调控谷氨酸能突触成熟，研究人员通过测量GFP、wtIR和dnIR表达组顶盖神经元中AMPA/NMDA比值（突触成熟度的指标），发现各组间该比值无显著差异（图5C、5D），沉默突触比例亦无变化。这表明胰岛素受体信号对AMPA受体介导的突触传递的建立或成熟并非必需。这些结果共同表明，胰岛素受体不会逆行影响突触前释放概率，且对谷氨酸能突触成熟非必需。因此，dnIR表达神经元中微兴奋性突触后电流频率的降低更可能是由于突触输入减少所致，这与视觉刺激反应减弱的结果一致。
为探究视觉反应减弱和自发性AMPA微兴奋性突触后电流频率降低是否源于dnIR表达神经元突触连接减少，研究人员采用电子显微镜评估顶盖神经元的突触密度。该方法还能提供突触前后结构的超微结构信息，用于评估突触成熟度。通过透射电镜对转染GFP、wtIR和dnIR的脑组织进行成像，在满足三个标准（停靠的突触前囊泡、清晰突触间隙、突触后致密区）的前提下，发现dnIR表达树突的突触密度不足GFP表达树突的一半（图6B），而wtIR表达树突的突触密度与对照组相当。这表明胰岛素受体信号调控突触连接的建立或维持。
图6 胰岛素受体调控突触数量
为检验dnIR表达神经元突触成熟度是否受影响，研究人员测量了突触前成分中聚集的突触小泡面积与突触前终末总面积的比值。既往研究表明该比值随突触成熟而增加，可作为突触成熟度指标。GFP、wtIR和dnIR三组间的突触成熟指数无显著差异（图6C），表明胰岛素受体信号不参与调控突触成熟，这与先前电生理测量的AMPA/NMDA比值结果一致。
为探究dnIR表达树突的突触减少是否具有区域特异性，研究人员比较了三组树突标记的突触后结构短径。结果显示三组间无显著差异（图6D），说明突触减少是树突树的全局性效应。
通过分析连续3天每隔24小时采集的顶盖神经元图像，发现三组细胞在树突总分支长度和分支末端数量等树突形态参数上无显著差异（参见在线图S1），表明胰岛素受体信号不影响整体树突发育。
胰岛素受体信号可能通过影响经验依赖性结构可塑性来调控环路功能。为验证此假说，研究人员采用4小时增强视觉刺激方案，比较有无视觉刺激时树突生长速率的变化。表达GFP或wtIR的神经元在视觉刺激期间树突生长速率显著提升（图7A、7B），而dnIR表达神经元则丧失此响应能力（图7A、7B）。这些结果表明胰岛素受体信号是视觉刺激诱导顶盖神经元树突生长加速所必需的。
图7 胰岛素受体信号调控经验依赖性树突结构可塑性
树突分支在数分钟至数小时内呈现动态变化，持续经历新增与消失、延伸与回缩的循环。黑暗与视觉刺激期间生长速率的变化可能源于动态分支行为相对分布的改变，包括分支长度回缩与延伸和/或分支末端消失与新增，因为这些行为分别反映不同的细胞分子机制。通过追踪黑暗期与视觉刺激期的单个末端分支，研究人员发现：在分支长度方面，GFP与wtIR表达细胞在黑暗期和视觉刺激期的分支回缩速率相近（图7C），而dnIR表达细胞在视觉刺激期间回缩速率显著升高（图7C）。GFP与wtIR表达细胞在视觉刺激期均表现出分支延伸加速（图7C），但dnIR表达细胞未见此现象（图7C）。
在分支末端分析中，根据黑暗期或视觉刺激期前后分支的存在状态，将每个分支分为稳定、消失或新增三类（图7D）。三组细胞在视觉刺激期间稳定分支均增加（图7E），且黑暗期与视觉刺激期的分支新增速率相近（图7E）。然而，GFP与wtIR细胞在黑暗期和视觉刺激期的分支末端消失程度相同（图7E），而dnIR表达神经元在4小时视觉刺激期间分支消失显著增多（图7E）。这些数据表明，胰岛素受体信号通过以经验依赖性的方式促进分支延伸、减少分支回缩和末端消失，进而推动树突结构复杂化。
三、讨论
突触连接具有动态特性，由持续至成年期的突触形成与消除平衡所决定。本研究利用非洲爪蟾视觉环路这一可进行分子操作、电生理记录及多模态成像的体内实验体系，证明胰岛素受体是顶盖神经元在视网膜-顶盖环路中接收正常水平视觉输入所必需的。胰岛素受体信号缺陷会严重抑制谷氨酸能突触传递，表现为dnIR表达神经元中AMPA微兴奋性突触后电流频率降低和视觉诱发突触电流减弱。超微结构研究证实这些效应源于顶盖神经元突触连接减少。此外，降低的胰岛素受体信号会阻断视觉刺激通常诱导的经验依赖性树突生长加速。这些数据共同表明，胰岛素受体信号通过调控突触密度、突触传递、经验依赖性树突结构可塑性及环路内传入输入响应，在神经环路功能中发挥关键作用。这些胰岛素受体功能降低导致的多样化后果，可能均源于该信号在兴奋性突触维持中的核心作用。
01.中枢神经系统胰岛素受体信号的细胞自主性功能
尽管传统认为大脑是胰岛素不敏感器官，但新证据提示胰岛素及其受体信号在中枢神经系统中具有重要作用。本研究开发了在单细胞水平操纵内源性胰岛素受体信号的工具，通过在未改变的整体环境中电转wtIR、dnIR构建体或吗啉代寡核苷酸，发现dnIR表达或moIR转染的神经元对所有测试光强度均反应微弱，表明胰岛素受体信号是顶盖神经元接收正常视觉输入所必需的（图3）。尽管wtIR在COS细胞中能增强胰岛素受体信号，但表达wtIR的神经元视觉反应未检测到统计学显著增强，可能由于配体、受体或下游信号通路处于饱和或限速状态，以保护细胞免于胰岛素受体信号过度激活。
02.胰岛素受体信号与经验依赖性树突可塑性
神经活动塑造中枢神经系统的突触连接与树突形态发生，尤其在感觉区域。本研究证明胰岛素受体信号参与经验依赖性结构可塑性，并通过解析黑暗或视觉刺激4小时内单个树突分支动态变化，揭示了视觉刺激诱导树突生长加速的细胞机制。增强视觉刺激会促使对照顶盖神经元通过增加分支延伸和末端稳定来提升树突生长速率；而缺乏胰岛素受体信号时，视觉刺激期间更多分支发生缩短和消失。这些发现与dnIR表达神经元突触密度降低相结合，提示胰岛素受体信号通过维持突触与分支来促进视觉经验诱导的树突延伸。该发现符合突触营养假说：突触形成与维持促进树突分支稳定，树突生长与突触数量及强度呈正相关。在非洲爪蟾顶盖中，视觉经验可提升树突生长速率、视网膜-顶盖突触发生及突触强度；斑马鱼研究也显示突触能稳定生长中树突并促进进一步分支生长。相反，阻断突触成熟会减少树突复杂化并完全抑制视觉刺激诱导的生长加速。因此，视觉刺激诱导的突触数量与强度增加似乎能稳定新延伸的树突分支。dnIR表达神经元无法响应视觉刺激加速生长，可能源于其低突触密度：一方面新分支上突触形成与维持受阻导致回缩；另一方面，在正常顶盖中单个转染的dnIR神经元（突触密度仅为周围细胞一半）视觉反应微弱，可能无法与正常邻居竞争视网膜输入，最终导致分支回缩与消失。
03.胰岛素受体信号与突触功能
突触密度降低、AMPA微兴奋性突触后电流减少及视觉反应减弱，与胰岛素受体信号可增强兴奋性突触功能的研究结论相一致。据报道，胰岛素通过PI3K-Akt-mTOR信号通路刺激海马切片和突触体中突触后密度-95蛋白的表达。此外，多种胰岛素受体下游分子被证实与兴奋性突触连接和树突结构相关。特别值得关注的是IRSp53——一种富集于大脑的胰岛素受体底物，作为突触后密度组分定位于突触。培养海马神经元中过表达IRSp53可增加树突棘密度，而RNAi敲低IRSp53蛋白则降低棘密度。生化研究显示，IRSp53直接与突触后支架蛋白Shank和PSD-95、小GTP酶Rac与Cdc42以及肌动蛋白调控因子WAVE2和Mena发生相互作用。这些数据表明胰岛素受体信号通过突触支架蛋白与细胞骨架的结合，与兴奋性突触接触的结构稳定性存在关联，且与我们前期研究中小GTP酶Rac和RhoA在顶盖神经元中介导视觉经验依赖性结构可塑性的发现相符。除Wang课题组报道胰岛素处理可增加GABA受体运输外，多数研究均显示胰岛素信号主要影响兴奋性连接。与此一致的是，我们的数据显示自发性GABA微抑制性突触后电流无显著差异，表明胰岛素受体信号可能在兴奋性突触中具有特异性功能。这些数据共同提示，在不同实验体系中，胰岛素受体信号可能通过细胞骨架重排介导对兴奋性突触输入的特异性调控。
值得注意的是，即使突触密度较低，树突复杂化仍可在数天时间内持续发生。神经营养因子BDNF的操控实验曾报道类似现象：虽然突触数量发生显著改变，但树突形态未受影响。在胰岛素受体信号的研究中，虽然4小时短期检测显示经验依赖性结构可塑性降低，但这些连日成像数据表明，在突触输入减少的条件下，替代机制可能参与了树突生长的调控。
总之，我们的数据表明胰岛素受体信号维持突触密度，并进一步支持这一观点：胰岛素受体信号受损所致的突触缺失会降低经验依赖性可塑性，最终导致包括信息处理与整合在内的神经环路功能缺陷。
四、实验方法
01.动物
实验室自殖或商业来源的白色非洲爪蟾蝌蚪饲养于12小时光/暗循环培养箱中。所有实验均采用阶段47/48蝌蚪。
02.免疫组化
用0.02% MS222麻醉爪蟾蝌蚪，4%多聚甲醛PBS液固定后，经30%蔗糖溶液进行冷冻保护。将完整头部切割成25μm厚水平冷冻切片。切片在10%山羊血清和0.3% Triton X-100的PBS溶液中封闭1小时，随后于4°C条件下与抗胰岛素受体β抗体孵育过夜。Tris缓冲盐溶液洗涤后，切片与Alexa Fluor 488标记的抗兔二抗孵育1小时。切片用Vectashield封片，并通过Zeiss LSM 510 Meta共聚焦显微镜成像。除特殊注明外，所有化学试剂均购自供应商。
03.质粒与吗啉代寡核苷酸
通过SMART RACE cDNA扩增试剂盒从5'和3' RACE cDNA文库中克隆获得两种形式的爪蟾胰岛素受体cDNA。为敲低两种胰岛素受体亚型，我们定制了针对爪蟾胰岛素受体保守区域的吗啉代寡核苷酸及含有五个错配位点的对照吗啉代。两种吗啉代均带有荧光标记，以便在体内识别转染神经元。此外，将含量更丰富的胰岛素受体亚型cDNA插入含两个CMV启动子的双向PCS2载体，使其一条链表达eGFP，另一条链分别表达wtIR、dnIR或不表达任何蛋白。通过定点突变试剂将胰岛素受体1058位点的赖氨酸残基替换为甲硫氨酸，构建dnIR点突变体，并经DNA测序验证。
04.免疫共沉淀与Western Blot分析
COS1细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，通过FuGENE 6转染仅表达GFP或共表达wtIR:CFP:HA与dnIR:CFP:HA融合蛋白的双启动子载体2天。细胞在无血清DMEM中过夜培养后，经0.1μM牛胰岛素刺激，立即用冰镇RIPA裂解液裂解。等量总蛋白经抗HA抗体免疫共沉淀后，通过抗磷酸酪氨酸抗体进行Western Blot分析。膜再生后使用抗IRβ抗体重新检测。吗啉代实验中，HEK293细胞按上述方法转染GFP、wtIR:CFP:HA和dnIR:CFP:HA后12-16小时，通过Endo-Porter导入moIR和moCTRL吗啉代。吗啉代导入2天后收集细胞，使用抗HA和抗微管蛋白抗体进行Western Blot分析。
05.神经元转染
在电生理学或电子显微镜实验中，通过电穿孔法对DNA质粒（0.68μM）或吗啉代寡核苷酸（500μM）进行顶盖神经元批量转染。该方法可使顶盖区域约3%-10%的神经元成功转染质粒，约20%的细胞转染吗啉代。实验在电转后3天的阶段47/48蝌蚪中进行。对于活体成像实验，采用单细胞电穿孔法转染单个视顶盖神经元。仅选择具有单个转染顶盖神经元的蝌蚪进行延时成像。
06.电生理学
在活体视觉环路分析中，将经麻醉处理的转染蝌蚪转移至含0.25毫简箭毒碱的HEPES缓冲细胞外液（115 mM NaCl, 4 mM KCl, 3 mM CaCl2, 3 mM MgCl2, 5 mM HEPES, 10 mM葡萄糖, 10 μM甘氨酸, pH 7.2, 渗透压255 mOsm）中以抑制肌肉收缩。剥离皮肤暴露大脑并沿背中线切开显露胞体后，将蝌蚪固定于细钨丝（California Fine Wire, Grover Beach, CA）支撑的灌流槽中，持续灌注含简箭毒碱的细胞外液。通过紧贴眼球的绿色LED光纤（530 nm Luxon III LED和2 mm光纤）提供覆盖全视野的视觉刺激。LED强度通过耦合在光纤上的中性密度滤光片调控，经IL1400辐射度/光度计测量的光纤辐射通量输出范围为3×10^-8至3×10^-1 mW，对应相对强度10^-8至10^-1。全细胞记录在-70 mV保持电位下进行，使用充灌细胞内液I（100 mM葡萄糖酸钾, 8 mM KCl, 5 mM NaCl, 1.5 mM MgCl2, 20 mM HEPES, 10 mM EGTA, 2 mM ATP, 0.3 mM GTP, pH 7.2, 渗透压255 mOsm）的玻璃微电极（6-10 MΩ）。视觉刺激方案包括光适应期（100秒内200 Hz的2.5毫秒脉冲，等效强度为刺激强度的50%）和光刺激期（100秒内0.2 Hz的2.5秒脉冲）。在记录受刺激眼球对侧视顶盖神经元时，从最低到最高强度重复四次该刺激方案。
对于自发性AMPA微兴奋性突触后电流记录，分离脑组织进行全细胞记录。在-70 mV记录电位下，细胞外液含1 μM河豚毒素和100 μM苦毒素，并使用细胞内液II（80 mM甲磺酸铯, 5 mM MgCl2, 20 mM四乙基氯化铵, 10 mM EGTA, 20 mM HEPES, 2 mM ATP, 0.3 mM GTP, pH 7.2, 渗透压255 mOsm）。每细胞分析3-5分钟记录数据，通过Axograph 4.6的模板匹配算法检测微兴奋性突触后电流。
在电刺激实验中，将双极刺激电极置于视交叉处激活支配顶盖的视网膜神经节细胞轴突。刺激强度设置为引发单个或少数量视网膜轴突向监测的突触后顶盖神经元传递信号，即所谓最小刺激。在-70 mV下用细胞内液I记录诱发的单突触AMPA受体介导电流，在+45 mV下记录NMDA受体介导电流。AMPA/NMDA比值通过无失败事件的AMPA峰值振幅除以AMPA峰值后20毫秒时间窗内无失败NMDA平均振幅计算。沉默（仅含NMDAR）突触比例按既定方法测定。在双脉冲比率实验中，施加成对刺激（25 Hz, 25-50次 trials），比率按AMPA峰值振幅比（EPSC2/EPSC1）计算。
进入全细胞模式后，数据采集前预留5分钟进行细胞内液平衡。所有报告电压均经过液接电位校正。神经元输入电阻范围为1-4 GΩ，串联电阻<100 MΩ，实验过程中持续监测。信号通过Axopatch 200B放大器测量，使用Digidata 1322A模数转换板数字化。刺激与数据采集通过pClamp 8.0软件执行，采样频率10 kHz。使用Axograph 4.6或Clampfit 10.0软件分析数据。所有设备与软件均来自Axon Instruments/Molecular Devices。
07.电子显微镜
将蝌蚪固定于3.5%多聚甲醛和0.25%戊二醛中2.5小时，按研究人员的方法处理。将含GFP免疫反应性的视顶盖切割成60纳米超薄切片，收集于pioloform包被的镍载网上，通过Hitachi 7500电子显微镜观察。使用NIH Image J分析树突、突触前和突触后结构的尺寸。结果来自三次独立实验。
08.活体成像与形态分析
单细胞电转后一天，筛选具有单个转染顶盖神经元的蝌蚪（总树突分支长度≤1000μm）。使用定制双光子显微镜对顶盖神经元进行活体成像。通过Olympus Fluoview软件以2倍变焦和z轴1.5微米步距采集图像，完整捕捉树突结构。采用Object Image软件配合定制宏指令手动完成树突三维重建。所有处理、成像和三维重建流程均采用盲法以避免偏差。
09.统计学检验
除特别说明外，组间比较采用非参数Mann-Whitney检验。数据以均值±标准误表示。显著性标记为：*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001。
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